摘要：合成了一系列以氨基酸和多肽为外周功能基团的醚-酰胺型树枝状化合物, 化合物结构经NMR, ESI-MS确证.并对该系列化合物在水溶液中的状态进行了分子动力学模拟.结果显示:化合物的构象与原子数相关, 随原子数的增加有逐渐接近球形的趋势;氨基酸α碳原子径向分布显示, 随着外周功能基团的增大, 分子可能存在部分卷曲构象.

关键词： 树枝状多肽化合物 合成 构象 分子动力学

自Vögtle等[1]报道树枝状化合物的合成以来, 在新材料、催化剂、药物载体、基因治疗等领域已有许多研究报道[2~4].近年来, 树枝状化合物的研究热点已不再是合成代数尽可能多、分子量尽可能大的分子, 而是在树枝状载体上连结不同的功能化基团, 使其具有多种多样性质的功能化树枝状化合物.最早提出的树枝状多肽化合物是Tam等[5]于1988年提出的聚赖氨酸型树枝状化合物.树枝状多肽化合物可以分为两种类型[6], 一种是以非肽树枝状化合物为载体连接上多肽片段, 另一种是直接以多肽作为树枝状化合物骨架.目前, 树枝状多肽化合物在作为疫苗、诊断试剂、免疫抑制剂、抗生素、药物载体等领域研究较多[7, 8].

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Gennes和Murat等[9, 10]先后报道了树枝状化合物的分子模拟研究, 但由于计算方法和计算条件的限制, 近年来该领域的研究才得到广泛的关注.Murat等[10]首先使用分子动力学方法考察了树枝状化合物的结构, 得到了关于分子结构的细节信息.进一步研究表明, 使用分子动力学模拟得到的化合物性质与实验得到的结果 (如分子大小, 氢键等) 相一致, 这也证明了该方法的可靠性.目前关于树枝状化合物的分子模拟工作, 主要集中在讨论不同结构类型和分子大小对传统结构树枝状化合物结构的影响, 而对树枝状多肽化合物的研究未见报道, 仅在最近有一篇会议摘要有所提及, 但并未说明使用的方法和得到的结果[11].

本文报道以聚醚-酰胺型树枝状化合物为核心, 分别以RGD三肽, GD二肽, 4种氨基酸为功能基团的7个树枝状多肽化合物的合成和分子动力学模拟研究, 探讨不同功能基团的大小与种类对树枝状多肽化合物结构的影响.RGD是人纤维连接蛋白与其受体的结合位点.含RGD序列的肽可以调节许多体内生理过程, 如:细胞粘附, 信号转导与识别, 血小板聚集, 肿瘤细胞转移等[12].

1 实验部分

1.1 树枝状多肽化合物的合成与表征

作者[14]采用DCC/HOBt方法曾合成了部分化合物2a, 2e, 2f, 该方法存在反应时间长, 后处理时DCU难以除尽等问题.本文改用酰氯法合成化合物2a~2f (图1) 以化合物2a为例, 时间缩短为约2 h, 收率由60%提高到80%, 且后处理简单.一般合成方法 (以化合物2a为例) :氮气保护下将化合物1 (424 mg, 1 mmol) 与2 m L SOCl2于50℃反应30 min, 减压除去SOCl2, 滴加甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐 (1.69 g, 5 mmol) 的二氯甲烷溶液和10 mmol三乙胺, 室温反应1 h, 减压浓缩, 经硅胶柱层析得产物2a[洗脱剂V (CH2Cl2) ∶V (MeOH) =80∶1~10∶1].

图1 化合物2a~2f和3的合成路线

1.1.1 化合物2a的合成

参照上述合成通法制备, 得到无色油状物812 mg, 产率81%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:2.43~2.51 (m, 8H) , 3.35~3.42 (m, 8H) , 3.63~3.67 (m, 8H) , 4.06~4.08 (m, 8H) , 5.15 (s, 8H) , 7.33~7.37 (m, 20H) .MS calcd for C53H64N4O16 1012.4, found 1013.3.

1.1.2 化合物2b的合成

参照上述合成通法制备, 得到无色油状物920 mg, 产率86%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:1.52~1.65 (m, 12H) , 2.50~2.56 (m, 8H) , 3.44~3.51 (m, 8H) , 3.69~3.75 (m, 8H) , 4.11~4.14 (m, 4H) , 5.10 (s, 8H) , 7.28~7.32 (m, 20H) .MS calcd for C57H72N4O16 1068.5, found1069.8.

1.1.3 化合物2c的合成

参照上述合成通法制备, 得到无色油状物1.204 g, 产率75%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:2.48~2.57 (m, 8H) , 2.61~2.76 (m, 8H) , 2.80~3.01 (m, 8H) , 3.40 (s, 8H) , 3.62~3.67 (m, 8H) , 4.50~4.56 (m, 4H) , 5.13 (s, 8H) , 5.17 (s, 8H) , 7.26~7.29 (m, 40H) .MS calcd for C89H96N4O24 1604.6, found 1605.8.

1.1.4 化合物2d的合成

参照上述合成通法制备, 得到白色蜡状物968 mg, 产率79%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:2.44~2.47 (m, 8H) , 2.81~2.86 (m, 8H) , 3.10~3.15 (m, 8H) , 3.42 (s, 8H) , 3.65~3.68 (m, 8H) , 3.70~3.78 (m, 12H) , 4.80~4.86 (m, 4H) , 6.84~6.99 (m, 4H) , 7.16~7.54 (m, 16H) .MS calcd for C65H76N8O16 1224.5, found 1225.3.

1.1.5 化合物2e的合成

参照上述合成通法制备, 得到淡黄色蜡状物1.613g, 产率88%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:2.66~2.69 (m, 8H) , 2.86~2.94 (m, 4H) , 3.00~3.08 (m, 4H) , 3.37 (s, 8H) , 3.72~3.79 (m, 8H) , 4.02~4.03 (m, 8H) , 4.55~4.57 (m, 4H) , 5.11~5.18 (m, 16H) , 7.25~7.38 (m, 40H) .MS calcd for C97H108N8O28 1832.7, found 1833.7.

1.1.6 化合物2f的合成

参照上述合成通法制备, 得到黄色蜡状物1.801 g, 产率70%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:1.55~1.68 (m, 16H) , 2.60~2.63 (m, 8H) , 2.87~2.93 (m, 4H) , 2.96~3.02 (m, 4H) , 3.26 (s, 8H) , 3.52~3.59 (m, 8H) , 3.68~3.73 (m, 16H) , 4.42~4.50 (m, 4H) , 4.78~4.85 (m, 4H) , 5.11~5.16 (m, 16H) , 7.24~7.42 (m, 40H) .MS calcd for C121H148N24O40 2577.0, found 2577.9.

1.1.7 化合物3的合成

将上述化合物2f 258 mg (0.1 mmol) 溶于5 mg甲醇中, 加入10 mg 10%Pd/C, 室温下催化氢化24 h后滤去催化剂, 减压抽去溶剂得到黄色蜡状物105 mg, 产率60%.1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ:1.52~1.63 (m, 16H) 2.50~2.55 (m, 8H) , 2.88~2.95 (m, 4H) , 2.92~3.00 (m4H) , 3.16 (s, 8H) , 3.48 (brs, 8H) , 3.59~3.65 (m, 16H) 4.35~4.41 (m, 4H) , 4.75~4.81 (m, 4H) , 6.94~7.03 (m4H) , 7.87 (brs, 4H) , 8.09 (brs, 4H) , 9.59 (d, J=8.4 Hz4H) ;13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ:174.7, 171.5, 169.6168.9, 156.6, 71.5, 67.2, 68.8, 54.3, 48.6, 45.5, 44.9, 42.136.8, 29.7, 28.2, 25.6.MS calcd for C65H108N24O32 1737.8found 1739.6.

2 分子动力学模拟

2.1 计算方法

树枝状多肽化合物的起始构型在Hyperchem中构建[15], 其分子量、原子数、周期性边界条件等在表1中列出.起始构型的构建依照Murat等[10]建立的方法: (1) 构建树枝状化合物核心; (2) 在树枝状化合物外周增加一个甘氨酸基团; (3) 在甘氨酸基团的α碳原子上增加相应的侧链; (4) 重复 (2) , (3) 步骤直到所有的氨基酸都添加完毕; (5) 在所有氨基酸的侧链和末端羧基上添加相应的保护基.每步操作后均进行较长时间的分子动力学模拟直到平衡为止.

表1 树枝状多肽化合物的性质和模拟参数

采用OPLS力场描述树枝状多肽化合物[16], 在模拟过程中把溶剂分子视为刚体, 使用LINCS和SETTLE算法进行约束分子动力学模拟.所有模拟工作均使用GROMACS 3.2.1软件包完成[17], 在等温等压 (NPT) 条件下进行, 使用BERENDSEN算法保持恒定温度 (298.15K) 和恒定压力 (101325 Pa) .溶剂可及面积和分子体积均使用TINKER软件包计算[18], 溶剂探针半径设为0.14nm, 其他计算由作者自编程序完成.

以分子力学优化得到的能量最低构象为初始构象, 将化合物以初始构象置于用分子动力学预先进行平衡的溶剂盒子中.所有化合物均进行200 ps的分子动力学模拟, 模拟的时间步长为0.001 ps, 在整个模拟过程中均记录模拟的轨迹和能量.

2.2 计算结果与讨论

化合物2f和3的溶剂可及表面如图2所示, 所有化合物的总电势能随时间的变化如图3所示.化合物的平均性质采样在最后100 ps内进行, 结果如表2所示.图4显示了氨基酸α碳原子与分子质量中心的距离变化的径向分布 (化合物2e, 2f, 3均取N端α碳原子) .由图可见化合物2a~2d及3的径向分布较窄且对称性较好, 提示分子的外周功能基团可能位于分子表面, 而化合物2e, 2f的径向分布较宽且没有明显的对称性, 分子构象相对复杂, 可能存在部分卷曲现象.

图2 化合物3和2f的溶剂可及表面

图3 树枝状多肽化合物总电荷能随时间的变化

图4 氨基酸α碳原子的径向分布

表2 树枝状多肽化合物分子动力学模拟结果

图5显示了分子的平均回转半径以及氨基酸α碳原子与分子质量中心的距离随总原子数变化的关系.由图可以看出, 化合物的RG和CRα随原子数的增大呈线性变化趋势.本文结果与Gennes和Hervet等[9]的结果是一致的[9], 但化合物3的RG和CRα与其它化合物的变化趋势有较大不同, 这可能是因为化合物3外周的极性基团较多, 从而可以与溶剂分子发生较强的相互作用, 出现伸展构象的几率较大.图6显示了化合物x, y, z轴的平均惯性动量之比随分子量变化的关系, 结果表明随着原子数的增加, 分子的Iz/Ix, Iz/Iy逐渐向1逼近, 表明分子结构随原子数的增加存在逐渐接近球形的趋势.

图5 分子的平均回转半径和α碳原子平均距离

图6 分子3个方向惯性动量的比值Iz/Ix, Iz/Iy随原子数的变化

表3显示了化合物2a~2f和3的平均溶剂可及面积和分子体积, 并计算了平均原子溶剂可及面积和体积.由表3可见, 随着外周基团的增大, 平均原子溶剂可及面积减少而体积变化不大, 表明了分子表面拥挤程度增加.化合物3的结果与其他化合物的变化趋势不同其原因可能是与溶剂分子发生较强的相互作用 (与图5的结果一致) .

以上分子动力学模拟结果显示, 树枝状化合物外周功能基团的大小和性质对分子在溶液中的构象起重要作用.由于树枝状多肽化合物在溶液中的构象有较大的柔性, 不同的结构类型, 外周基团的种类和大小均对其构象有较大影响.进一步研究不同代数, 不同外周基团以及不同溶剂体系对树枝状化合物构象影响的工作正在进行中.

表3 树枝状多肽化合物经分子动力学模拟得到的溶剂可及面积和分子体积

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